Abs缸actTi廿e:Stlldy HanceMajor:Botany Name:Han xia signatllre: SuperVisor:W.angYi-ling signature: Abstract wi仙in椭ebmiIy Asteraceae,pe陀nniaI he山, compreses two aendemicplant MountainTaihang. our present、ork inVeStigated gene悄cstructure aI瞻伪qp习搦P“sShih lncIuding 14popuIations.The main resUltS were liSted fIalawS:1)The length 733-766bp.GCcontant hassjgn嘲cant di仟brences bet、een 17Var置abIesiteS tn lTS region, 11e饷cientVa—able sjtes.The repIaCe ITS2.2)The phyIogenetic reIationships among 14populations maximumkeIihood IML)and NeighbolUoining(NJ).The popuIation onecIade. Except LLS SBthepopulation onecIade. 3)There 365VariabIe sites chIoropIast,and244 e怖cient variabIe sites. Gst=0.30093 ,Nst=0.24383 ,Fst=0.23809, Nm=0.78。 The genetic structure js more 山西师范大学学位论文 II compIicated WDSf--om haplotypes.H1 ancienthapIo埘pes, distancebetween them js close-And haVehigher f-.equency:There 172vanabIe sites ch-oropIast,and159 e竹icient variabIe sites-The genetic structure morecompIicated WDSfrom ancienthapIotypes,and distancebetween them haVehigher frequency:And populationa-expansion. 【Key Wbrds】印西砌叩唧螂Shih,Ph妒ogeographical,ITS,棚L.棚F, Thesis】BasicresearCh 目次 目次 第一章绪论……………………………………………………………..1 1.1太行菊属动物研究布景……………………………………………………………。l 1.1.1太行山地域的天然地舆前提…………………………………………………1 1.1.2太行菊属动物的生物学特征…………………………………………………1 1.1.3太行菊属动物的研究现状……………………………………………………2 1.2谱系地舆学……………………………………………………………………..3 1.2.1谱系地舆学引见…………………………………………………………3 1.2.2谱系地舆学相关理论…………………………………………………………3 1.2.3谱系地舆学研究中常用的标识表记标帜…………………………………………5 1.3本研究的目标取意义………………………………………………………………..7 1.4研究内容………………………………………………………………………………8 1.5拟处理的环节问题……………………………………………………………………8 1.6本研究的手艺线…………………………………………………………………..9 第二章材料取方式………………………………………………….1l 2.1尝试材料…………………………………………………………………………….1l 2.2太行菊属动物总DNA的提取及纯度检测……………………………………….12 2.2.1太行菊属动物总DNA的提取步调…………………………………………12 2.2.2 DNA纯度的检测…………………………………………………………………………………12 2.3 PCR扩增及产品检测………………………………………………………………1 32.3.1引物的筛选……………………………………………………………………13 2.3.2 PCR扩增及产品检测………………………………………………………。l 32.4数据统计取阐发……………………………………………………………………14 2.4.1ITS数据统计…………………………………………………………………14 2.4.2叶绿体基因数据统计…………………………………………………………l 5第三章成果取阐发…………………………………………………1 73.1 ITS数据成果取阐发………………………………………………………………..17 3.1.1太行菊属ITS序列碱基构成…………………………………………………l 73.1.2 ITSl、5.8S rDNA及ITS2序列特征比力阐发……………………………..17 3.1.3各居群间遗传距离阐发……………………………………………………..18 3.1.4基于最大似然法和邻接法建立的系统发育树成果………………………..18 3.2棚L棚F数据成果取阐发………………………………………………………….21 3.3,l砌J.加L数据成果取阐发………………………………………………………….23 3.4基于结合数据成果取阐发…………………………………………………………25 第四章会商…………………………………………………………29 4.1基于太行菊属序列成果的会商……………………………………………………29 4.1.1基于ITS数据成果的会商…………………………………………………..29 4.1.2基于棚L.加F、,l砒J.f聊L数据及结合数据成果的会商…………………29 4.2遗传布局取种群分化………………………………………………………………30 4.3太行菊属种群进化汗青……………………………………………………………3 14.4现今谱系地舆款式构成缘由………………………………………………………32 山西师范大学学位论文 4.5太行菊属动物策略探冗……………………………………………………….33 4.5.1当场……………………………………………………………………..33 4.5.2迁地……………………………………………………………………..33 4.5.3其他策略………………………………………………………………。34 第五章结论………………………………………………………….35 称谢……………………………………………………………………………………37 参考文献…………………………………………………………….39 附录A太行菊属各个居群间的遗传距离…………………………47 附录B基于棚L.加F序列单倍型分布环境……………………..48 附录C基于棚L.棚F序列单倍型变异位点及替代消息………一49 附录D基于刀砒J.棚L单倍型变异位点………………………….58 附录E太行菊属叶绿体结合数据单倍型分布环境……………….56 附录F太行菊属各个居群间的Nst和Gst值…………………….57 攻读学位期间颁发论文…………………。………………………….59 绪论 第一章绪论 1.1太行菊属动物研究布景 1.1.1太行山地域的天然地舆前提 太行山雏形构成于吕梁活动期间,海水正在奥陶纪中期逐步退去。正在晚古生代期间,山体发生凹 陷,使海水侵入;中生代时,南部上升,北部局部拗陷。正在喜马拉雅活动期间表示为强烈断裂,并 且伴有大幅度拗曲,构成复式单斜褶皱【l’31。 太行山山前有断裂带,位于太行山脉取华北平原的过度区域,正在早第三纪期间,因为西北.东南 向拉张为从的重生代裂陷感化,使得太行山构成一些新的断裂【2。3】,这些构成了一些隔离。第四纪以 来,太行山南缘地域又快速的隆升,有强烈的断裂勾当,这些对太行菊的构成和分布具有必然 的影响。 太行山区海拔一般正在lOoo米以上,总面积1049万公顷,北高南低。北起西山,横跨、 河南、山西3省,南达黄岸,是我国东部地域的主要山脉,也是中国陆地地形第二阶梯的东部 边缘。太行山脉处于带取暖温带最北界,为工具。太行山东部接近华北平原,山前洪积扇 出格发育。西部呈阶梯状逐步没入山西高原。山中具有多处雄关;如壶关、娘子关、紫荆关、虹梯 关等。山西高原的河道经太行山流入华北平原,峡谷连接,多湍流瀑布,如壶口瀑布。 太行山的天然植被垂曲温差面差别较大,例如小五台山的南坡,以1000米为分界线,以下次要 是灌丛,以上有落叶松或云极。北坡1600米以下是夏绿林,1600-2500米是高亚草原。 太行山全区地势复杂,分歧的省区,太行山脉的天气略有分歧。 河南省太行山段天气属性季风天气,受和海洋气团的交替影响【4】,冬季流行西冬风, 夏日多东南风,四时分明,冬冷夏热,年平均气温为13.28,年平均无霜期190天,年平均降 水量为695mm,多雨年降水量多达到1027mm,少雨年只要376.6mm,年平均日照时数为2363.7h。 省太行山段天气属性季风天气,特点是冬季寒冷少雪,夏日炎热多雨;春多风沙, 秋季风凉,各地气温差别较大,年平均气温正在4.13之间,全年无霜期有1lO.220天。一般的年 平均降水量约正在400.800毫米之间,年平均日照时数为2235.8h。 山西省太行山段天气属性季风天气,年平均气温为9,年平均降雨量为700 mm~l 000 mm,水热前提优越。年平均日照时数为2034h。 1.1.2太行菊属动物的生物学特征 太行菊属动物为多年生草本动物,耐干旱、耐阴、耐寒、瘠薄,具有很强的抗逆性,通体富含 芳喷鼻油,干后喷鼻味持久。叶为羽状,边缘花为雌性,舌状,仅1层;地方盘花两性,管状,多 数‘5羽。舌状斑白色或者粉红色,舌片为线齿裂。花药基部钝,顶端附片为 三角形:花柱分枝线性,顶端截形。瘦果很小,具有4.6个芒片状冠毛,分手或仅正在基部稍连系, 全数芒片集中于瘦果后背顶端,瘦充饥面顶端,无芒片包被。花果期为6—9月。 山西师范大学学位论文 该属共有2种,为我国太行山区特有,分为长裂太行菊印妇历嗍淞zD馏.f?:D6淞Shih和太行菊 Dp西纸叩卿淞细访硎聊施(LiIl曲C.Shill,此中太行菊为该属的模式种。分布于我国河南,, 山西三省,尤以河南的辉县,林州,济源,的邢台,武安,磁县,山西的晋城陵川等地居多 【7-9】,此中,河南是太行菊属动物的次要发展地。 太行菊正在河南济源被叫做野菊花,本地以头状花序替代菊花,具有更好的清肝明目结果;动物 花色纯洁或粉红,具有较高的抚玩价值;农业园艺栽培动物菊花的野生近缘种,是菊科育种中的沉 要种质资本;太行菊可提取芳喷鼻油,用于喷鼻料的制做;别的,太行菊属分布区狭小,且具有奇特的 生态,繁衍能力较弱,且因为太行菊的药用价值,使得报酬采摘严沉,现正在曾经处于濒危形态, 被列为国度第二批珍稀动物‘协15】,属于极危。 1.1.3太行菊属动物的研究现状 a.太行菊属组织培育方面 姚连芳(2004)对发展期的太行菊茎顶芽和带腋芽的茎段进行了组织培育试验,获得了最优的 灭菌处置。正在其根本上,王建博(2008)成立了太行菊顶芽离体高效再生系。 b.太行菊属属间杂交育种方面 近年来,很多学者努力于太行菊属的属间杂交工做。广义菊属的属间杂交次要是操纵远缘杂交, 获得具有双亲优秀性状的杂交种。李玮(2006)将匹菊属、短舌菊属、亚菊属、菊属和太行菊属进 行属间杂交,研究发觉太行菊属和亚菊属、太行菊属和菊属、亚菊属和匹菊属的亲缘关系较近。杨 德艳(2010)对菊属及近缘属进行了属间的杂交试验,第一次获得了亚菊属、菊属及太行菊属三个 属的属间杂交种,且确定了杂交种的线)以太行菊属的太行菊取亚菊属、菊属等 进行远缘杂交,培育出杂交种。 李健(2008)对太行菊的生殖进行了研究,认为太行菊整个染色体组共有9对染色体,此中,8 对常染色体和l对性染色体,核型公式为2n_2x_18=16nl+2sm,染色体的相对长度变化范畴从8.78 到13.31。通过对太行菊的杂交试验,发觉其杂交坚苦,健壮率极低,通过左胚手艺获得少量杂 赵宏波(2007)对东亚春族系统演化环境进行了研究,初次提出太行菊属等单型属为二倍体(2n_18),且二倍体为该族的祖征。通过核糖体ITS序列和叶绿体加l【/棚F IGS间区序列,将 太行菊属正在东亚春族的系统演化关系进行了切磋,认为蒿亚族取太行菊属、女蒿属、 j}印D玎册肪绷柳l等为系统树的一个分支,具有较近的亲缘关系。 c.太行菊属花粉研究 (2011)对太行菊属动物分歧居群的花粉形态进行了研究,太行菊属花粉有3个 是单粒花粉,外形为球形或者近球形,通过极面不雅的察看,发觉太行菊为三裂圆形。正在扫描电子显微镜下花粉外壁纹饰以刺.颗粒状复合纹饰为从,体积较小。 d.太行菊属遗传多样性研究 高亚卉(2012)采用S鼬廿及cpSSR标识表记标帜研究了太行菊属种群的遗传多样性,成果表较着 绪论示正在10对cpSSR引物的扩减产物中,有5对引物的扩减产物有多态性,多态位点百分率(PPB)为 44.6%,这申明太行菊的遗传多样性偏低。5个位点正在153个个别中扩增等位基因数(Na)平均为 1.414,无效等位基因数(Ne)平均为1.024,Neis基因多样性指数(He)为O.076,sh锄0n多样 性指数为0.134,基因分化系数(Gst)为0.242,表白太行菊属动物的变异次要来历于群体内,群体 间分化较小。用MEGA5软件进行UPGMA聚类阐发,并对地舆距离和遗传距离相关性进行Mental 查验,表白遗传距离取地舆距离之间存正在显著的正相关。基于cpSSR数据阐发供给的遗传消息为太 行菊遗传多样性的和操纵供给了必然的根据。 1.2谱系地舆学 1.2.1谱系地舆学引见 按照“布丰定律”的揣度,地球上的分歧区域,前提即便不异,的动、动物也各不 不异【29。311。从这个意义上来说,生物的分布不只取生态相关,也遭到汗青要素等的影响。汗青 要素包罗地舆汗青,也包罗类群演化的汗青。鉴于此,应运而生的是谱系地舆学这一概念。 谱系地舆学(Phylogeography)是1987年由JollIl Avise提出的一个生物地舆学的分支学科。谱 系地舆学的次要研究内容是种间及种内支系之间的亲缘关系以及现有分布款式取地质汗青事务 (如冰河、地舆隔离时间)之间的相关性。这一研究的目标是为了研究遗传谱系空间分布的汗青特 硭31硼。 谱系地舆学将一个的遗传变异取生态学和汗青地质事务相连系,从时间和空间的角度对一 个进行描述。该学科是生物地舆学的一个主要分支,融入了生物学、系统发育生物学、古 地舆学、统计学、遗传学和汗青生物地舆学等学科的精髓,将构成(种上程度)和群体遗传(种 下程度)进行无机结创3”7】,切磋遗传谱系地舆款式的构成机制和汗青演化。 谱系地舆学取生物地舆学的次要不同正在于研究一个所利用的【3。生物地舆学次要研究 高分类阶元类群的地舆分布环境,利用的包罗现今的形态特征、或迁徙体例及化石证 据,而谱系地舆学则偏沉于亲缘关系较近的或者种内群体等分类阶元类群较低的群体研究,使 用的数据一般是数据。取保守的系统发育树比拟,谱系地舆学要求沉建基因谱系,操纵基因的 单倍型(haplotype)来建立系统发育收集图,还能够由此揣度居群中分歧地质年代所履历的进化事 1.2.2谱系地舆学相关理论谱系地舆学做为一门科学成长至今,也发生了很多相关的理论。 正在地球的演化过程中,温度经常会发生较大的波动。正在温度较低时,高纬度地球可能会构成大 陆冰原,正在高海拔山区构成山地冰川,冰川的天气前提对于生物的分布和扩散有着很大的影响。冰 期出亡所(refIl西a)就是正在这一汗青前提下发生的,凡是是指正在冰期,出格是比来一次冰期,动植 物为逃避恶劣天气选择的相对集中的区域,跟着冰川的衰退和温度的回升,幸存的生物会环绕这一 核心从头分布开来,这一过程被称之为冰期后的从头扩张【38枷】。通过对冰期出亡所的研究,来 山西师范大学学位论文分歧地域的之间具有的亲缘关系。因为空间的隔离,统一正在分歧的下可能会发生变异, 这使得该分化,从而导致新种或新亚种的构成。隔离的单个群体能够被当做冰期出亡所,也可 以由多个群体的隔离区域形成。出亡所因为其奇特的地舆前提出格适合于的取繁衍,具有 丰硕的生物多样性,成为生物多样性的热点区域。 正在谱系地舆研究中,人们还发觉了微出亡所(microrem舀a),指的是正在冰期,并不必然退 缩到一个或几个低纬度的出亡所,而是留正在具有适宜的局部特征的小区域,使得动动物能够正在 晦气的地域前提中的小群体不遭到影响并存活于的次要分布区之外。通过对高山 出亡所的研究,发觉有冰原岛峰出亡所(nunatak refigua)、周边出亡所(p甜pheral re如西a)、低地避 难所(10Wl她d refh西a)等。 通过对出亡所以及微出亡所的研究,能够理解动动物对于汗青天气变化是若何响应的,这有帮 于我们研究全球天气变化对生物的影响。现正在全球天气正正在逐步变暖。通过近几十年的研究, 目前的天气变暖慢慢改变了的地舆分布范畴:低纬度地域的有向高纬度地域迁徙的趋向, 或者从山区低海拔区域向高海拔迁徙。而因为天气变暖导致正在正在低纬度和低海拔地域适宜生境 削减的同时,某些种并没有迁徙的倾向,或者因为地舆前提的,使得它们面对的。 溯祖理论(coalescent t11eoq)是一种切磋种内或近缘间基因谱系关系的数学统计和方。 正在1982年由‰gm孤正式提出,其后经Do衄elly和Tava挹对其进行完美。该理论认为,一个特定 的群体中,所有的等位基因均由一个配合先人遗传而来,其遗传关系能够通过基因谱系进行再现。 该理论既是谱系地舆学猜测进化汗青的根基理论,也是群体遗传学中基于基因谱系的同推理论, 能够用来切磋群体的迁徙、基因交换、生殖隔离和杂交事务,以及猜测谱系分化事务及达到比来共 同先人时间的理论根本【41451。 每一个正在天然界的汗青上都有其特定的分布,而间断分布的更遭到人们的关心。对于 这种间断分布的现象,谱系地舆学有两种分歧的注释,扩散(dispersal)和隔离(Vic撕ance)。扩散 过程是随机发生的,而且正在分歧类群发生的环境各有分歧,这个过程是不成查验的。可是由隔离引 起的生物地舆款式是能够查验的。谱系地舆学的成长过程一曲着隔离和扩散之间的辩论,可是 越来越多的研究表白,对于分歧的生物来说,构成体例各不不异,这一过程中隔离和扩散都起 着很大的感化。 基因流(geIle now)是指统一的分歧群体之间,或者统一群体的分歧个别之间基因消息的 取交换,它能够通过花粉、种子及克隆体的迁徙或者活动来实现,其大小遭到体例、 机制及群体间地舆距离的影响‘4143】。基因流对于群体内部以及群体之间遗传变异程度具有主要的影 响,其大小、频次和类型间接影响着的遗传多样性款式。基因流次要用来反映群体问遗传分化 的程度,凡是,基因流大的,其群体间的遗传分化程度低;基因流小的,群体间的分化程 基因间的交换使两个群体遗传同一化,而遗传漂变(geneticR)则刚好相反。这一概念是1930年由群体遗传学家Se,all提出的,指的是因为随机选择惹起的群体中等位基因频次的变化H“71。正在 绪论相对较大的种群中,由取样效应所惹起的基因频次变化相对比力微弱,且凡是能够忽略;可是这种 影响正在种群数量较少(凡是小于100)的种群内,表示的极为显著,并且基因的变化没有固定的方 向。种群越小,遗传漂变的影响就越为显著。取洗染选择分歧的是,遗传漂变并不是因为或是 顺应压力所惹起的,因而因为遗传漂变惹起的等位基因频次的改变对的下一代发生的影响并不 能确定。 遗传布局(geIl舐c s帆ctl鹏)用来反映的遗传多样性正在群体中的分布形式f451。除了群体 的大小、构成和繁育环境外,群体遗传布局还能够显示群体的隔离程度及迁徙的时空形态刚7’52‘53。 通过对遗传布局的研究,能够阐发遗传变异取生态、地质汗青的关系,还能够深切理解进 化的过程。群体遗传布局遭到多方面的影响,不只包罗地质汗青过程,还包罗基因流、遗传漂变、 繁育系统等要素。 奠定者效应(found盯efI‰t)是遗传漂变的一个特例,是指仅仅通过少数个别成立并成长构成的 种群,这些个别成长构成的新种群遗传多样性较低,并不克不及完全反映其源种群的遗传消息。这一效 应次要发生正在较为封锁的区域,或者正在分布区的边缘。正在决定一个群体哪些基因得以保留的过程中, 机率起到了环节的感化,这对儿女的基因库有着深远的影响。 进化中性学说(Neu昀l吐lco巧ofm01elar evolution)认为一般环境下,大大都基因突变时 不会有天然选择和适者的环境发生,生物的进化次要是由这些中性突变正在天然群体中随机发生 “遗传漂变”而导致的。突变率仅仅是影响核苷酸的置换速度,进化较快的基因正在内和间存 正在更多的遗传变异。凡是认为群体正在持久的进化过程中,核苷酸突变概率是不异的,这种概率的改 变维持一种均衡形态。 1.2.3谱系地舆学研究中常用的标识表记标帜 广义的标识表记标帜是指可遗传的并可进行检测的卵白质标识表记标帜或DNA标识表记标帜。卵白质标识表记标帜指正在卵白质 多态性根本上成长的标识表记标帜,如等位酶等。狭义的标识表记标帜仅是指妊标识表记标帜,指正在DNA水 平上对生物间的差别进行检测。聊叮A标识表记标帜次要有两类,一类是DNA序列数据,一类是对研究 物质中进行全基因组的扫描,如扩增片段长度多态性(脚)、简单反复序列间隔区(ISSR)、随机 扩增片段多态性DNA(黜心D)、简单反复序列(SSR)等。 动物谱系地舆学的研究最大课题是选择适合种内程度,可以或许供给脚够变异消息的曲系同源序列 标识表记标帜。动物DNA序列按照此中细胞中的,能够分为三品种型:核DNA(nucleus DNA,IlE)NA)、 叶绿体DNA(chloroplast DNA)和线粒体DNA(IIlitochon“a DNA)。按照此中细胞中基因能否进行 表达,可将其分为编码基因和非编码基因,编码区分为外显子和内含子。分歧的、分歧的DNA 区域正在进化速度上存正在着很大的差别,这种差别能够用于分歧分类阶元的系统发育研究,针对某一 特定的系统学问题,若何选择适合的片段是系统学研究的环节所正在。 最早利用的标识表记标帜存正在于线粒体基因中,目前,次要用于动物的谱系地舆学研列53。541。动物 线粒体基因组的碱基替代率比力低,导致其进化速度较慢,别的,动物线粒体基因组正在大小和布局 上都不是很不变,存正在高频次的反复、缺失和沉排的现象,以及外源DNA的转移等,对动物谱系地 山西师范大学学位论文 理学研究有必然的障碍。 高档动物的叶绿体DNA为双链共价闭合环状,其长度因生类分歧有所差别,其大小正在 120kb到220kb之间,被2个长度约为22-25kb的反向反复序列分成大拷贝区(1arge sin百ecopyre百on, LSC)和两个小单拷贝区(锄all sin西e copyre西on,SSC)【55巧6】。凡是,1个叶绿体包含10-50个DNA ,内有少量的核糖体,且叶绿体是半自从性细胞器,本身具有遗传消息的表达系统,能够通过 和翻译,生成卵白质,可是叶绿体中绝大大都的卵白质是由核DNA进行编码,正在细胞质核糖体 中合成后再转运到叶绿体各功能位点上。 叶绿体DNA正在谱系地舆学中使用最为普遍,由于其具有以下特点:基因组小但包含了大量DNA 消息;正在程度上可以或许供给无效的消息支撑,分歧区域进化速度分歧,可合用于分歧分类阶元的 系统发育研究:两个反向反复序列的进化速度取单拷贝区比拟要低,编码区的核苷酸替代率低,适 于较高分类阶元的系统发育研究,而非编码区的替代率较高,可用于较低分类阶元和近期分化类群 的系统学研究"59】;仅具有母本的遗传消息,细胞时不进行沉组,能够用于逃溯发源和迁徙, 利于地舆学的研究【4引。 晚期操纵叶绿体基因组次要是对整个叶绿体基因组进行性片段的阐发,性酶切位点以 及酶切长度的变化来反映必然的多态性。后来成长为操纵PCR手艺对cpElNA序列扩增,然后进行 性片段长度多态性阐发。跟着cpSSR通用引物的开辟和成长,越来越多的cpDNA非编码区序 列数据进行谱系地舆学研究。很多学者操纵cpDNA单倍型(hyplotype)的分布来猜测种群的发源、 迁徙和分化。常用的cpDNA片段分为两类,编码区和非编码区。因为进化速度分歧,利用的片段有 所分歧。此中,编码区序列有r6cL、,,l口水、的m、刀口肝等,非编码区序列次要有铆lL.F、口矽B.如L、 叶绿体基因组凡是用来反映汗青事务所遗留的踪迹,而核基因组则凡是用来群体近期发生的遗传事务,如基因流环境。因而,正在叶绿体基因组数据对群体进行阐发的根本上,还要连系核基 因组的遗传消息来进行谱系地舆学的研究。核基因组DNA很是复杂,理论上能够满脚谱系地舆学研 究的需求。它包含双亲的遗传消息,具有较快的进化速度。 ITS(int锄al拄aIlsc曲ed spacer)序列凡是正在研究属内种间和较近的属间关系中表示出较高的多 态性和消息位点百分率,可认为动物内部的系统发育沉建供给较好的支撑‘61‘631。目前正在谱系地舆学 研究中,核基因组序列次要操纵编码核糖体砌叮A的反复区(nrDINA)。每个反复单位包含外间 隔区(EST)、18S基因、第一内间隔区(ITSl)、5.8S基因、第二内间隔区(ITS2)和26S 基因,反复单位之间为基因间隔区(IGS)。此中,nrDNA中的编码区序列(18S、5.8S、26S)为高 度保守区,合用于高分类阶元的系统发育研究;IGS为高变区,ITS(图1.1)为中度保守区,这两 者可用于较低分类阶元的系统发育及群体遗传学的研究。 绪论图1.1 ITS区布局示企图 Fig.1.1 The stmctll弛diagram o“TS聆gion 谱系地舆学次要切磋的问题有:遗传多样性分布款式,猜测冰期出亡所,估量近缘种或种 内各遗传谱系的不合时间(divergence time)以及确定单位(conservation units)【件661。 的遗传多样性对其和成长起着决定性感化,通过构成、演化、迁徙过程中履历的 所有汗青地质事务及近期群体间基因的交换,构成了现有的分布款式[67—11。通过筛选适合的分 子标识表记标帜,阐发群体遗传多样性分布款式,进而猜测构成、演化及迁徙过程,对汗青进行再现。 冰期出亡所的猜测凡是操纵孢粉、化石、古天气、古地质、古植被变化等,可是因为化石、 孢粉等的缺乏,对某些的冰期出亡所无法猜测,因而,将生物学数据通化石材料连系 起来,猜测冰期出亡所,并沉现群体汗青动态。 碱基的替代率正在分歧的、基因组或功能区是分歧的,可是正在某些特定的、基因组和功 能区,其替代相对保守,替代率恒定。钟(molecularclock)认为,虽然核茁酸或氨基酸替 代速度的察看会由于随机误差有必然影响,可是正在去进化过程中相对恒定【6硒71,按照溯祖理论,利 用等位酶或DNA数据,连系孢粉、化石和古生物学数据,来估算动物近缘种或种内各遗传谱系 的不合时间【俳711。 谱系地舆学还能够用来确定遗传多样性核心,按照类群的种间关系和分类学地位等,来确 定进化显著单位(evolution si印ificaIlt units,ESUs)。这些研究都为濒危动物等的策略制定及提 供无效的办法供给必然的理论根本【72‘741。对于分歧,因为其多样性程度和群体遗传布局的 差别,应采用分歧的办法。 本研究操纵ITS和加zL.加F、,z砌J.咖L三种引物,对太行菊14个居群109个个别进行扩增, 并对响应数据进行阐发。 1.3本研究的目标取意义 谱系地舆学的研究可以或许深切领会演化取天气汗青事务、地质前提之间的关系‘75。771,特别是 正在辨别第四纪蒙受冰川笼盖区域内的出亡所以及沉建它们冰期后的迁徙线等方面具有主要意 义‘4H31,从而更有帮于领会遗传变异取地舆分布之间的关系,为开展对各类原生种质资本的保 山西师范大学学位论文护供给理论根据。 针对太行菊属动物的研究,正在谱系地舆方面还比力少,并且以往的标识表记标帜数和消息量也略显不脚。 本文通过采集分布正在我国山西、、河南等3个省的14个太行菊天然居群109个个别,从细胞核 和细胞质程度通过DNA测序手艺来研究太行菊属动物系统发育关系、谱系地舆款式、冰期可能 的出亡所及冰期后的迁徙径,为更好地这种特有动物供给。 太行菊是我国、河南、山西这三省的特有动物,次要分布正在河南新乡、济源,邢台、 磁县和山西陵川、晋城等地的太行山区,是国度珍稀濒危动物,急需进行相关研究对其进行保 本研究拟筛选了适合的11rS和叶绿体基因序列,对太行菊属天然分布范畴内的14个居群进行扩增,对扩增成果进行测序,对其遗传多样性、遗传分布款式进行阐发,判定单倍型的分布模式及居 群间的系统发育关系,并阐发现有分布款式构成的汗青缘由取第四冰期时可能的出亡所。 太行菊属是我国特有的濒危,我国一曲努力于对濒危的工做。通过对其遗传多样 性及遗传分布款式的阐发,制定太行菊属动物的办法。 1.4研究内容 a.遗传多样性取种群分化 本研究选用11rS和叶绿体基因组对太行菊种群进行测序,比力阐发太行菊属动物天然种群的遗 传布局和遗传分化,对其进化潜力进行阐发,切磋太行菊属持久进化过程中基因流等要素正在种群遗 传分化中的感化。 b.太行菊属种群进化汗青 按照11rS和叶绿体基因组测序成果,阐发种群个别和种群间差别,建立太行菊属基因谱系树, 并连系现今的地舆分布款式,切磋进化过程中履历的汗青事务,再现太行菊属进化汗青上的遗传差 c.现今谱系地舆款式构成缘由从单倍型分布款式入手,操纵测序成果,阐发现今谱系地舆款式构成缘由。并寻找可能的冰期 出亡所。 d.太行菊属动物的办法 通过对太行菊属遗传布局的研究,制定太行菊属动物的办法,对太行菊属进行更为无效的 。 1.5拟处理的环节问题 a.拟通过尝试获得遗传多样性取种群分化数据 b.通过尝试数据研究太行菊属种群进化汗青 c.探究现今谱系地舆款式构成缘由,并寻找可能的冰期出亡所 d.按照研究太行菊属遗传布局,制定太行菊属办法 绪论 1.6本研究的手艺线 通过野外查询拜访记实太行菊属天然居群的生态特征,每个居群采样5-20个个别,操纵硅胶将其干 燥后带回尝试室,提取所有居群的DNA。操纵11rS和叶绿体基因组引物对其进行扩增,按照ITS序 列成果切磋太行菊属各天然居群间的亲缘关系;操纵叶绿体基因非编码区序列成果,勾勒叶绿体单 倍型收集分布图、并连系古地质学、古天气学材料切磋太行菊属动物的种群进化汗青、冰期出亡所 及可能的迁徙线,并对其谱系地舆款式进行研究。手艺线如下所示: 太行菊属DNA的提取 用ITS引物扩增 扩减产物测序 用叶绿体基因组引物扩增 扩减产物测序 切磋太行菊属植群进化汗青 探究太行菊属动物现今谱系地舆款式构成缘由 山西师范大学学位论文10 材料取方式 第二章材料取方式 2.1尝试材料 通过查阅相关材料和记实地消息,采集尝试材料。所有材料的采集工做于20lO年和2011年的 5.8月进行,别离采自山西、河南、3省的太行山区,根基笼盖了太行菊属动物的分布区。采样 点如表2.1所示。 表2.1材料来历及样本数 采样点样本数 经度 纬度 海拔 太行菊SNS 河南神农山 15 112044’ 35016’ 1028 太行菊 河南伏羲峰8112062’ 35011’ 1120 太行菊 XTS 河南仙台山 5113049’ 3401l’ 1000 太行菊 BJY 河南白家岩 4112092’ 35046’ 979 太行菊YTS 河南云台山 6113025’ 35025 71000 太行菊WWS 河南王屋山 6112026’ 35038’ 946 太行菊 GS 河南关山 8113034’ 34045’ 1396 太行菊WML 山西王莽岭 6113035’ 3504l’ 142l 太行菊XYG 山西锡崖沟 6113034’ 3504l’ 754 长裂太行菊 SHS 双皇山 81l 3057’ 36054’ 732 长裂太行菊WDS 武当山 16 113。47’ 36057’ 1253 长裂太行菊 LLS 河南林虑山 71l 302 734043’ 950 长裂太行菊 SBY 河南石板岩 411 3032’ 36003’ 1000 长裂太行菊 BXT 北响堂 10 114009’ 36002’ 756 太行菊属动物分布于黄河道域附近,分布较为集中,具体分布环境如图2—1所示。 ??WML……一;XYG~…一 …Gsww眨哺封静: 图2.1.太行菊属居群采样点Fig.2—1 The s锄pled locations 山西师范大学学位论文2.2太行菊属动物总聊悄的提取及纯度检测 2.2.1太行菊属动物总DNA的提取步调 本研究采用改良的CTAB法提取速太行菊属全基因组DNA。 a.取适量长嫩无病斑叶片置于2lIll Eppelldorff管中(约占管内总体积的1/5),插手适量抗坏血 酸、PVP和石英砂,用仪器破坏成粉末状; b.加预处置核分手缓冲液(STE)800山,正在常温下放置lOmin,然后正在6000n,min下离心1miIl, 用移液枪吸收上清液,弃去;反复该步调;插手预热至65的CTAB提取液800“l,充实混匀,使 材料取提取液完全接触,65温浴120min,其间每隔10min轻细震动一次; c.取出Eppelldorfr管冷却至室温,插手等体积氯仿.异戊醇溶液(体积比24:1)抽提lOmin,8000 rpm离心lOmill,取上清液,用同样的方式吸收氯仿.异戊醇反复抽提2次; d.向上清液中插手2倍体积的无水乙醇(.20冷藏),轻细夹杂后置于4静置30.60mill,可 见白色絮状DNA沉淀; e.12000 rpm离心2min,弃上清液,将沉淀用70%乙醇洗涤2.3次,用200011珊离心20min, 倒去乙醇,用吸水纸吸干乙醇; f.正在沉淀DNA插手适量O.1TE消融研叮A,短期利用置于4、持久置于-20备用。 2.2.2 DNA纯度的检测 a.采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的纯度及浓度。 (1)称取0.69琼脂糖,倒入100lInl烧杯中,正在100lIIll量筒中倒入5缓冲液l oIIll,插手二次水至 50ml,用玻璃棒搅拌; (2)正在微波炉里加热,并用玻璃棒不竭搅拌,留意察看以防缓冲液溢出,曲到缓冲液,将缓 冲液放正在室温下冷却; (3)正在电泳板上插上梳子,将烧杯中的琼脂糖倒入电泳板,冷却至凝固,取下梳子; (4)将样品用移液枪转移至电泳板的孔内,正在点样纸上点溴酚蓝2uL,使DNA样品6uL取之混 合平均; (5)正在电泳缓冲液为1TBE,电压70V,电流30IIlA前提下,插手适量DL2000 Marker(R岫De, 西安润德生物手艺无限公司)电泳30min,操纵Bio.Rad凝胶成像系统。 按照电泳条带的划一度、点样孔中荧光的有无估量DNA的纯度。 b.用分光光度计检测DNA浓度 测定230nm、260nm、280nm处的光接收值,按照A260/A280比值及A230的值确定DNA纯度。 A260/A280=1.8~1.9指高纯度的DINA;A260/A280=1.9~2.0意指高纯度的RNA;正在280nm的接收 会降低该比例,申明样品被卵白质污染:正在230nm处的接收申明有酚或尿素污染样品。操纵260nm 处的光接收值来估测样品DNA的浓度(1A260=50nuL dsDNA)。将模板DNA稀释到50ng/ul